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NDETM3000轉染試劑


產品介紹:

NDETM3000轉染試劑是威斯騰生物研發的一款新型陽離子聚合物(非脂質體)轉染試劑。NDETM3000帶有更高的正電荷,能夠高效壓縮DNA/RNA,將DNA/RNA包裹在聚合物的內部,通過細胞自身的胞吞作用,進入細胞內吞體中,然后通過吸收內吞體中的H+,改變其PH值,使內吞體解體,將DNA/RNA釋放到細胞質中,實現DNA/RNA的高效轉染。

 

產品特點:

NDETM3000轉染試劑具有以下特點:

——轉染效率高

——溫和低毒

——性價比高

——易于針對廣泛的細胞類型進行優化

目前已驗證NDETM3000可以高效轉染(>80%)的哺乳動物細胞系有:HEK293、HeLa、CHO、COS;昆蟲細胞系有:Sf9Sf21;對其他細胞系也有一定的轉染效率,包括某些原代細胞系,在優化的條件下可實現40-60%的轉染效率。

此外,可以使用NDETM3000進行腺病毒、慢病毒和腺相關病毒高效包裝,其中慢病毒初始液滴度最高可達107TU/ml,經超離或超濾濃縮后,最終滴度可達109TU/ml(病毒包裝優化步驟可以登陸威斯騰生物官方網站查詢下載)。

 

貼壁細胞轉染步驟:

6孔板培養體系為例,進行哺乳動物細胞系轉染。其他培養體系,參考表1調整。

1.轉染前一天,將細胞接種6孔板,使轉染時細胞匯合率達6080%;

注意:細胞狀態對任何轉染試劑的轉染效率都有著至關重要的影響,在轉染前,應該觀察細胞狀態是否良好;對于剛復蘇的細胞,建議傳三代后再進行后續轉染實驗,以保證細胞處于旺盛生長期。

2.轉染前1-2h,更換2ml新鮮DMEM+5%FBS培養基;

注意:對于293系列易轉染的細胞系可以不換液;而要得到最優化的轉染效果,建議使用2%-5%的血清可以得到更高的轉染效率。

3.1.5ml無菌EP管中加入100μl Opti-MEM(或者其他無血清培養基),隨后吸取2μg質粒轉移至Opti-MEM中,輕輕混勻,室溫靜置5分鐘;

注意:Opti-MEM和質粒從冰箱取出后,先讓其恢復至室溫,然后再進行轉染操作;質粒在轉染前請混合均勻。

4.34μl NDE3000轉移至Opti-MEM中,輕輕混勻,室溫靜置15分鐘;

注意:NDE3000從冰箱取出后,先讓其恢復至室溫,然后再進行轉染操作;在轉染前請混合均勻。

5.靜置完畢,用槍頭輕輕來回吸打上一步混合液3次后,再轉移混合液至細胞培養基中,輕輕搖勻,將細胞放回37°C培養箱中繼續培養;

注意:來回吸打混合液可以更充分地分散NDE3000與質粒DNA形成的復合物。

6.16-20h后,更換新鮮的完全培養基,繼續培養24-72h后檢測基因表達。

注意:轉染24小時可以檢測到目的基因表達,但RNA和蛋白最高豐度表達分別出現在48小時和72小時。

Table .1 不同培養皿NDETM3000轉染試劑用量

培養皿規格

表面積(cm2

接種細胞數()

培養基量(ml

稀釋液體積(μl)

DNA的量(μg

NDE3000的量(μl)

96孔板

0.3

1.2-2.4X104

0.1

10

0.1-0.2





以質粒ug數乘以1.5-2 ul,例如2μg質粒,需要3-4ul NDE3000

48孔板

1.0

4-8X104

0.2

20

0.2-0.4

24孔板

1.9

0.8-1.6X105

0.5

50

0.5-1.0

12孔板

3.5

1.5-3X105

1

50

1-2

6孔板/35mm

9.6

4-8X105

2

100

2-4

60mm

21

0.9-1.8X106

4

200

6-12

100mm

58

2.2-4.4X106

10

500

12-24

T75

75

3-6X106

15

1500

18-36

 

懸浮細胞轉染步驟:

250ml Shake flask(振蕩培養瓶)培養體系為例:

1.轉染前2小時,接種5.0*107細胞至250ml Shake flask;

注意:細胞狀態對任何轉染試劑的轉染效率都有著至關重要的影響,在轉染前,應該觀察細胞狀態是否良好;對于剛復蘇的細胞,建議傳三代后再進行后續轉染實驗,以保證細胞處于旺盛生長期。

2.向15ml 離心管中加入2.5ml Opti-MEM(或者其他無血清培養基),隨后吸取50μg質粒轉移至Opti-MEM中,輕輕混勻,室溫靜置5分鐘;

注意:Opti-MEM和質粒從冰箱取出后,先讓其恢復至室溫,然后再進行轉染操作;質粒在轉染前請混合均勻。

3.100μl NED3000轉移至Opti-MEM中,輕輕混勻,室溫靜置15分鐘;

注意:NED3000從冰箱取出后,先讓其恢復至室溫,然后再進行轉染操作;在轉染前請混合均勻。

4.用槍頭輕輕來回吸打上一步混合液3次后,再轉移混合液至細胞培養基中,輕輕搖勻,將細胞放回37度培養箱中繼續振蕩培養23小時。

5.添加25ml新鮮完全培養基后繼續培養36-72h后檢測基因表達。

注意:轉染24小時可以檢測到目的基因表達,但RNA和蛋白最高豐度表達分別出現在48小時和72小時。



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